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金线莲百科

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野生金线莲总黄酮及多糖含量测定
作者:山珍金线莲 发布于:2013-11-18 0:51:43 点击量:
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  1、材料与仪器

  1.1仪器

  UV-2550紫外分光光度计(日本岛津);AEL-40SM十万分之一天平(日本岛津);干燥箱CS-101-2CS(重庆实验仪器厂);KQ2200E医用超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),HH-2数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)。

  1.2试剂

  芦丁对照品购于中国药品生物制品检定所;葡萄糖、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯。

  1.3药材

  1~8号金线莲全株于2007-10分别采集,经文山师范高等专科学校生化系沐建华讲师鉴定无误(见表1),样品洗净,于80℃干燥至恒重,粉碎(过60目筛)备用。表1开唇兰属植物样品(略)

  2、方法

  2.1总黄酮及多糖的提取流程

  称取金线莲材料1g,用滤纸包好置于脂肪抽提器中,用甲醇200ml作溶剂提取,回流提取到提取液接近无色,停止回流,收集甲醇提取液,用甲醇定容至200ml进行总黄酮含量测定;把残渣转到锥形瓶中,用选择好的提取工艺进行提取,得到提取液,用蒸馏水定容至800ml进行多糖含量测定。

  2.2总黄酮测定方法

  2.2.1标准曲线的制作[4]

  精密称取120℃干燥至恒重的芦丁对照品10mg用20ml乙醇溶解后,转移到100ml容量瓶中,加水至刻度,摇匀即得(溶液中含无水芦丁的含量为0.1mg/ml)。精密吸取芦丁标准液0.0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0ml。分别置于50ml容量瓶中,各加水至12ml,加5%NaNO2溶液2ml,混匀,放置6min,加10%Al(NO3)3溶液2ml,混匀,放置6min,加4%NaOH20ml,再加水至50ml,放置15min,以不加芦丁对照品的试剂作空白对照。按分光光度法在503nm(全波长扫描,在503nm处有最大吸收)波长处测定吸光度。以所取标准液含有的芦丁标样量mg数和吸光度数据经回归处理,得到回归方程:Y=0.2196X-0.0112,相关系数r=0.9993。

  2.2.2总黄酮含量计算方法

  精密吸取1.0ml多糖提取液,按“2.2.1”项下内容操作,再根据下列公式计算,测定结果。

  样品中的总黄酮含量(以芦丁计):

  总黄酮含量(mg/gDW)=200CW

  式中:C为1ml样品液含黄酮量(mg),W为金线莲样品质量(g)。

  2.3多糖测定方法[5]

  2.3.1标准曲线的制作

  精密称取105°C干燥至恒重的无水葡萄糖标准品25mg,置于250ml容量瓶中,加蒸馏水至刻度,配成0.1mg/ml的标准溶液。分别移取上述标准溶液0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0ml,依次加水使最终体积为1.0ml,另取1.0ml蒸馏水作为空白。每一试管中加入1.0ml5%苯酚溶液,混匀,迅速加入5.0ml浓硫酸,振摇5min后放置35min,在最大吸收波长490nm处测定吸光度,得回归方程:A=5.8824C-0.0003,r=0.9954。其中A为吸光度,C为葡萄糖浓度(mg/ml)。

  2.3.2多糖含量计算方法

  精密吸取1.0ml多糖提取液,按“2.3.1”项下内容操作,再根据下列公式计算,测定结果。

  样品中的多糖含量(以葡萄糖计):

  多糖含量(mg/gDW)=800CW

  式中:C为1ml样品液含多糖量(mg),W为金线莲样品质量(g)。

  2.3.3芦丁回收率的测定

  准确称取3号金线莲样品甲醇提取液取20ml共3份,分别加入一定量的芦丁对照品,按“2.2.2”项下操作。用紫外分光光度计测定吸光度,得出总黄酮含量,根据回收率公式计算出回收率。

  回收率(%)=(混合后测得总黄酮含量-样品中总黄酮含量)芦丁对照品加入量×100%

  2.3.4总黄酮测定

  精密度实验精密吸取3号金线莲样品甲醇提取液1ml,共6份,按“2.2.2”测定。

  2.3.5葡萄糖回收率的测定

  经过“2.3.3”处理后的残渣用水作溶剂进行提取,得到的提取液取20ml共3份,分别加入一定量的葡萄糖对照品,按“2.3.2”项下方法操作。用紫外分光光度计测定吸光度,得出多糖含量,根据回收率公式计算出回收率。

  回收率(%)=(混合后测得总黄酮含量-样品中总黄酮含量)葡萄糖对照品加入量×100%

  2.3.6多糖测定

  精密度实验经过“2.3.4”处理后的残渣,进行水提,得到的提取液定容至800ml,精密吸取1ml,共6份,按“2.3.2”项下方法

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